猪流行性腹泻病毒 COE 抗原表位的原核表达及鉴定

为更好地了解近年来仔猪流行性腹泻疫情,收集上海地区猪流行性腹泻病猪的临床样品,扩增猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因（COE 基因）,构建原核表达载体 pColdⅡ-COE,转化至大肠埃希菌 pG-Tf2／BL21,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 结果显示,表达的 COE 蛋白大小为16 ku,Western blot 分析表明,该蛋白与临床上猪流行性腹泻病毒阳性猪的血清有特异性反应,说明所表达的 COE 蛋白具有反应原性,为进一步研制猪流行性腹泻疫苗和 ELISA 检测方法奠定了基础。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

猪流行性腹泻病毒感染Vero-E6细胞诱导凋亡机制的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞凋亡的机理,本研究利用荧光定量PCR方法结合流式细胞术检测PEDV感染Vero-E6细胞后凋亡分子的变化情况.荧光定量PCR结果表明,抑制细胞凋亡因子Bcl-2在PEDV感染后基因转录水平迅速升高,在24 h达到峰值后被抑制;而促凋亡因子的蛋白水解酶caspase8和caspase3在PEDV感染后基因转录水平也随之提高,在48 h达到峰值.流式细胞术结果表明PEDV感染细胞48 h后促凋亡分子中的蛋白水解酶Caspases被活化.该研究结果揭示了PEDV感染细胞能够拮抗细胞存活信号通路,引起细胞凋亡,其中凋亡调节因子Bcl-2、caspase3和caspase8在细胞凋亡发生过程中起关键作用.     

Role of soybean β-conglycinin subunits as potential dietary allergens in piglets

β-Conglycinin, a major seed-storage protein in soybeans, is one of the primary antigenic proteins responsible for soybean-meal hypersensitivity in weaned piglets. The protein is a heterotrimer composed of subunits α, α′ and β. It is currently unknown which of the β-conglycinin subunits are allergenic for piglets. The aim of this study was to identify potential allergenic subunits of β-conglycinin for soybean sensitive piglets and to characterise these subunits by immunoglobulin (Ig) G and E immunoblotting, ELISA, ‘skin prick’ and whole blood histamine-release testing. The IgG and IgE binding capabilities of the purified α, α′ and β subunits of β-conglycinin were determined by immunoblot analysis and ELISA with sera from β-conglycinin sensitised piglets. Skin prick testing and whole blood histamine release testing were also performed to detect the activated effector cell response to specific allergens. Specific IgG and E antibodies were identified that recognised all three subunits of β-conglycinin in the sera of β-conglycinin sensitised piglets. All three subunits of β-conglycinin elicited positive skin test and specific histamine release responses from the whole blood of β-conglycinin sensitised piglets. These results suggest that all three β-conglycinin subunits are potential allergens for piglets.     

猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用简

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）检测方法,试验据GenBank中PEDV基因组序列,设计并合成针对M基因的内、外2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示,单一使用外引物或内引物进行常规RT-PCR时检测限量均为50 pg PEDV RNA模板,而使用巢式RT-PCR可检测到50 fg PEDV RNA模板。使用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。结果表明,建立的巢式RT-PCR方法特异性、敏感性好,可快速准确地检测出样本中微量PEDV核酸。     

一株仔猪屎肠球菌的分离及其种属鉴定

为分离出可用作猪用微生态制剂的肠道益生菌株,本研究选择锦州市凌海大业乡生态猪场为试验采样点,采集10日龄左右健康仔猪肠道粪样12份。利用MRS琼脂培养基分离培养初筛目标分离菌株的形态特征和培养特性,再通过生理生化鉴定法和16SrRNA基因分子鉴定法,最终确定1株分离菌为屎肠球菌,并命名为LN／EFl312株。为后续肠道益生球菌的益生功能研究奠定了物质基础。     

腹泻仔猪与健康仔猪粪便菌群多样性的比较

本试验旨在探究腹泻仔猪与健康仔猪粪便菌群多样性及结构的差异。采集同等饲养条件下的8份腹泻和8份健康哺乳仔猪的粪便样本,利用16S rRNA高通量测序技术对健康仔猪和腹泻仔猪粪便菌群进行比较。结果表明:健康仔猪粪便菌群的多样性高于腹泻仔猪(P<0.05);与健康仔猪粪便菌群组成相比,腹泻仔猪变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度增加(P<0.05),而拟杆菌门(Bacteroidetes)降低(P<0.05);在属的分类水平上,腹泻仔猪粪便中埃希氏-志贺菌属(Escherichia-Shigella)和乳杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度高于健康仔猪(P<0.05),而拟杆菌属(Bacteroides)、Lachnoclostridium和瘤胃球菌属(Ruminococcus)低于健康仔猪(P<0.05)。综上表明,腹泻仔猪与健康仔猪粪便菌群的多样性和结构存在显著差异,埃希氏-志贺菌属的相对丰度显著增加可能是仔猪腹泻的重要原因之一。     

细小病毒引起犬猫疾病的差异性研究

细小病毒感染犬猫是如今困扰饲主的主要问题,目前无特效药,治愈率低,主要治疗原则为对症治疗和支持疗法。采用评分制记录治疗过程中犬猫体况,比较犬猫达到呕吐评分=0,腹泻评分≤1,开始进食及完全采食的时间,为临床治疗及护理提供理论依据。在细小病毒感染犬猫的治疗过程中,犬的重点护理期不小于3 d,猫的重点护理期不小于1周,且护理幼猫时,需人工强饲。调整犬猫治疗方案,减少呕吐时间和腹泻时间,可有效提高治愈率。     

兔源支气管败血波氏杆菌和肺炎克雷伯菌的分离鉴定及其对抗菌药物的敏感性分析

兔感染支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）后，常引起兔多发性呼吸道疾病，严重危害家兔养殖业。作者剖检河南省某兔场疑似病死兔，并采集组织分离鉴定病原菌，然后进行药敏试验，以期确定引起兔呼吸困难、腹泻的病原。结果显示，经细菌分离培养得到1株革兰阴性、两端钝圆的小杆状可疑致病菌及1株革兰阴性、卵圆形的可疑致病菌；其16S rRNA基因序列扩增片段大小分别为1 492和1 494 bp，与B. bronchiseptica AU 12671和K. pneumoniae菌株F5feb.57相似性分别为99.85%和100.00%，即该兔场患病兔为B. bronchiseptica和K. pneumoniae混合感染。药敏试验结果显示所分离的B. bronchiseptica和K. pneumoniae同时对庆大霉素、头孢曲松、头孢唑啉3种药物敏感，对其他药物有不同程度的耐药性。综上表明，此次分离的细菌为B. bronchiseptica和K. pneumoniae，本试验为家兔B. bronchiseptica和K. pneumoniae混合感染的分离鉴定及科学用药提供参考。     

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件，为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒，对接毒时细胞维持液中胰酶浓度（0、2、4、6、8和10 μg/mL）、细胞密度（40%、60%、80%、100%、200%）、接毒剂量（MOI分别为1、0.1、0.01和0.001）、吸附时间（0、30、60、90、120、240 min）、收毒时间（接毒后12、24、36、48、60、72 h）、维持培养温度（35、36、37和38 ℃）和转瓶转速（6、8、10、12、14、16 r/h）7个条件进行优化。结果显示，PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为：细胞刚铺满单层时接毒，接毒量为MOI=0.01，维持液（无血清DMEM培养液）中胰酶质量浓度为6 μg/mL，不需吸附，维持培养温度为37 ℃，12 r/h 旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液，效价可稳定达到10^6.50 TCID₅₀/0.1 mL。本试验为 PEDV 变异株大量培养提供了参考，为变异株疫苗研发奠定了基础。